巖陀ITS2片段PCR擴增條件優化及物種鑒別研究

2019-07-05 02:37:27 現代園藝·綜合版2019年3期

方強強 王燕

摘要:以巖陀植物葉片為材料,利用試劑盒提取方法提取植物葉片中的DNA,對ITS2序列進行PCR擴增條件優化并對ITS2序列鑒別物種能力進行考察;通過單因素實驗分別研究退火溫度、DNA模板量、循環次數等因素對巖陀DNA條形碼鑒別中所選的ITS2序列擴增反應的影響,并對擴增體系進行優化,采用Seqman7.1軟件對測序峰圖進行校對拼接,應用MEGA計算種內種間遺傳距離,采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹;結果表明:優化后的PC R擴增反應體系總體積為25μL, 含TaqPCR Master Mix 12.5μL、DNA模板量5ng、上下游引物(10mol/L)各1μL、ddH2O9.5μL,ITS2序列在退火溫度設置為60℃,循環次數為30次的條件下進行PCR擴增,獲得清晰單一的電泳條帶,ITS2測序成功率100%,比對后的序列長度475bp,GC含量約50%、種內種間變異存在重疊,沒有明顯的Barcoding gap;結論:通過試劑盒提取巖陀植物葉片DNA,在優化后的PCR擴增反應體系對ITS2序列進行擴增,可以滿足后續對鬼燈檠屬多基原植物巖陀的親緣關系、物種鑒別和遺傳多樣性等領域的研究,但ITS2序列不適合巖陀種DNA條形碼鑒別。

關鍵詞:巖陀;DNA提取;核糖體ITS2;PCR擴增條件;側序;分子鑒別

巖陀來源于虎耳科鬼燈擎屬植物西南鬼燈檠(Rodegersia sambucifolia Hems1)或羽葉鬼燈檠(Rodegersia pinnata Franch)干燥根莖Ill,為苗族、白族、傈僳族等民族常用藥材,分布于我國云南、貴州、四川、陜西、甘肅、寧夏、河南、湖北、西藏等省區,而云南省資源最為豐富,3種鬼燈檠:西南鬼燈檠(Rodegersiasambucifolia Hemsl.)、七葉鬼燈檠(Rodegersia aes-culigolia Batalin)、羽葉鬼燈檠(Rodegersia pinnataFranch)均有分布。因其具有清熱解毒、收斂、消炎、祛風除濕等功效[2],對腸炎、菌痢、風濕骨痛、外傷出血、老年性支氣管炎等常見疾病有較好療效而得以廣泛使用[3]。但由于多基原民族藥巖陀利用傳統方法很難鑒別,3種鬼燈檠來源的巖陀藥材混淆使用,用藥安全難以保證。因此,為了保證中藥臨床用藥的安全有效可控,利用生物學方法(DNA條形碼技術)構建巖陀DNA條形碼識別系統很有必要,而建立DNA條形碼系統的前提條件為DNA提取及PCR擴增條件的選擇與優化。DNA條形碼技術是一項新的分子鑒別技術,擺脫傳統鑒別方法中需要豐富的物種鑒別知識的束縛,而且還可以構建相應數據庫,實現物種快速準確鑒別[4]。因此,本研究中選用植物DNA條形碼鑒別中常用序列ITS2,進行物種鑒別能力考查,以期為其它藥用植物在種屬鑒別方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:植物組織研磨儀、Ohaus corporation CP114型電子天平、SIGMA1-14ED臺式離心機、VOR-TEX-kylin-Bell型旋渦震蕩儀,DYCP-31DN型電泳儀、Bio-Rad SmartSpec Plus蛋白質核酸定量檢測儀、Bio-Rad My Cycler型PCR擴增儀。

試劑:乙二胺四乙酸二鈉(Ethylene diamine te-traacetic acid,EDTA)、Tris(北京索萊寶)、溴化乙錠(Ethidium Bromide,EB)、6×DNA Loading buffer(北京索萊寶);瓊脂糖(Agarose LE)、DNA quick Plant System(非離心柱型)、Taq PCR Master Mix(2x,red dye)、DNAMarker[均購自北京天根生化科技有限公司;硼酸、異丙醇、氯仿、氫氧化鈉、無水乙醇、氯化鈉等為國產分析純。

1.2 材料采集與處理

實驗研究所用鬼燈檠屬的3個品種的巖陀植物由課題組成員2018年7月采自云南省大理蒼山。樣品由大理大學藥學與化學學院生藥教研室張德全博士鑒定完成,憑證植物標本存放于大理大學藥學與化學學院王燕課題組,樣品采集信息表見表1。

1.3 DNA的提取

采用試劑盒法,取經硅膠干燥處理后的巖陀植物葉片約20mg于離心管,加入400μLFP1和6KLRNase,旋渦振蕩1min,室溫放置10min:后加入130μL緩沖液FP2,混勻旋渦振蕩1min,12000rpm離心5min,取上清液于新的離心管中,重復操作1次;向上清液加入0.7倍體積的異丙醇,充分混勻12000rpm離心2min,棄上清液;加入600μL70%乙醇,旋渦振蕩5s,12000rpm離心2min,棄上清液,重復操作1次;開蓋倒置5~10min,加入50μL緩沖液TE,充分混勻使其溶解,-20℃貯存備用。

1.4 DNA純度的檢測

將提取的DNA溶液適當稀釋后,采用核酸蛋白成像儀進行純度檢測,記錄A260和A280吸光光度值,以A260/A280的比值鑒定純度。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳,0.5*TBE buffer(54g Tris,27.58硼酸,20mL 0.5mol/LEDTA(pH值8.0》,瓊脂糖凝膠成像儀觀察并拍照。

1.5 ITS2序列擴增反應和程序

PCR擴增在Bio-Rad MyCler型PC R擴增儀進行擴增,引物參考陳士林[4]課題組設計的序列,由生工生物工程(上海)公司合成。引物序列為:ITS2F ATGC-GATACTTGGTGTGAAT;ITS3R GACGCTTCTCCA-GACTACAAT。

PCR擴增反應體系中的Taq PCR Master Mix采購自北京天根,加入量按產品說明為準;引物濃度10μM;樣品DNA模板加入量1 μL(1-10[,g/mL)。初始反應程序為:第1階段:預變性,94℃,4min;1個循環;第2階段:變性,94℃,30s;退火,45~68℃,30s;延伸,72℃,45s:30~35個循環;第3階段:72℃10min,1個循環,終止反應,4℃保存。

1.6 ITS2測序及物種鑒別

PCR擴增的序列送至華大基因科技(武漢)有限公司進行雙向測序。利用seqman7.1去除序列低質量區和引物區并對測序峰圖進行校正拼接,利用軟件MEGA7.0計算種內種間遺傳距離值并構建系統發育樹,利用Taxon DNA軟件對種內種間遺傳距離分布進行概率統計,并繪制Barcoding gap圖,比較種內種間遺傳差異,對ITS2序列鑒別能力進行評估。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

試劑盒提取結果如圖1,試劑盒提取的總DNA條帶明亮,但由于試劑盒本身的原因,總DNA條帶中部分條帶存在彌散和點樣孔有亮斑的現象,可能存在少量蛋白質、糖類、酚及RNA等雜質沒有去除干凈,植物總DNA提取過程中總DNA中存在少量雜質的污染,不會對后續PCR擴增產生影響。條帶存在但采用試劑盒提取方法提取DNA方便快捷,課題組在利用不同方法提取DNA的過程中發現,利用試劑盒提取方法對經硅膠干燥葉片的提取DNA效果較佳。故本試驗采用試劑盒提取樣品DNA。

2.2 ITS2序列PCR擴增條件優化

2.2.1 退火溫度的優化。退火溫度是影響PCR特異性的重要因素,變性后溫度快速冷卻至40~60℃,可使引物和模板發生結合。由于模板DNA比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機率會遠高于模板互補鏈之間的碰撞[5]。不同的引物有著不同的退火溫度,而退火溫度的選擇取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度(對于序列數在20bp,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度最為理想。引物理論退火溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)[6]。實際退火溫度要根據具體樣品的不同擇優選擇,實驗設定44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃等10個梯度的退火溫度,10種退火溫度以篩選最合適的退火溫度結果見圖2。當退火溫度在44~62℃之間均能有效擴增且條帶明亮,3~10號條帶非特異性擴增較明顯。隨著退火溫度升高至60℃,PCR反應特異性略有提高。退火溫度高于60℃時,擴增效率無明顯改變,但擴增特異性有所下降,ITS2序列擴增退火溫度選擇60℃比較合適。在Tm值允許范圍內,選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合,提高PCR反應的特異性。退火時間一般為30~60s,足以使引物與模板之間完全結合[6]。后續條件優化均在該優化退火溫度基礎上完成。

2.2.2 DNA擴增模板量的選擇。DNA擴增所加入的模板量也是影響PCR擴增的重要因素,模板量少影響PCR擴增產物的濃度,模板量多又會出現非特異性擴增。因此,為了獲得最佳擴增條帶,考察模板加入量很有必要。實驗樣品選擇101號樣品,核酸濃度檢測該樣品A260=0.164,A260/280=1.85,樣品提取濃度為45.8592μg/mL,在25μL的反應體系中設定8個DNA模板用量梯度,加入模板DNA量分別為0.05ng/25μL、0.2ng/25μL、0.4ng/25μL、2ng/25 μL、5ng/25μL、20ng/25μL、40ng/25μL、70ng/25μL。不同模板加入量得到的擴增結果如圖3,模板原液加入量在5~40ng的范圍內DNA條帶明亮,考慮節約模板量與實驗的操作的準確性,選擇每25μL反應體系加入模板量為5ng較為合適。

2.2.3 擴增循環次數。確定合適的退火溫度和DNA模板加入量后,選擇合適的循環次數可以降低非特異擴增量。實驗設定6個循環次數進行擴增DNA擴增結果如圖4,表明PCR擴增反應第2階段30個循環較為合適,該條件同時滿足目標產物的擴增量和低非特異擴增量。

2.2.4 優化條件組合的PCR擴增結果。以優化條件組合對巖陀10個品種提取的DNA模板進行PCR擴增,擴增后的結果在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,0.5*TBE buffer,溴化乙錠染色,瓊脂糖凝膠成像儀拍照觀察如圖5,在500bp處有一條明亮的條帶,表明優化條件適合ITS2反應要求。

2.2.5 ITS2片段的PCR產物則序及序列數據處理。10條ITS2序列,由華大基因科技(武漢)有限公司進行雙向測序,測序成功率100%。測序所得峰圖采用Seq-man7.1.0進行校對拼接,去除引物區和低質量區,運用MEGA7.0軟件對拼接后的序列進行比對,基于Kimu-rat-Parameter雙參數模型和距離法中的(neigh-bor-joining,NJ)計算遺傳距離,構建Barcoding gap圖和系統發育樹,系統發育樹中各分支相對支持率采用Bootstrap模式檢測,自展次數設置為1000,Gap/missingDate Treatment模式選擇complete deletion計算。

3 ITS2序列鑒別分析

3.1 ITS2序列特征

各樣本所得的ITS2序列經MEGA比對后所得序列長度為475bp,GC含量50.84%,保守位點99.6%,變異位點0.2%,簡約信息位點0.2%,變異位點較低,利用ITS2序列作為種下鑒別較為困難。

3.2 ITS2序列種內種間差異性分析

利用MEGA7.0軟件計算鬼燈檠屬巖陀種不同樣品之間的遺傳距離,K2P計算結果表明,種內種間平均遺傳距離分別是0.00079和0.00099,種間遺傳距離分布于0~0.00213。種內種間差異性分析見表2,理想的DNA條形碼應該滿足:種間最小遺傳距離大于種內最大遺傳距離,但表2數據結果表明最小種間遺傳距離的平均值為零。因此,ITS2種內種間差異性分析并不能很好的表明ITS2對巖陀種間的鑒別能力。

3.3 ITS2序列Barcoding gap檢驗

MEGA7.0軟件計算樣品種內種間遺傳距離值,采用Taxon DNA軟件對種內種間遺傳距離概率分布進行統計,并制作出ITS2序列的Barcoding gap圖,見圖6。如圖所示,ITS2序列的種內種間變異重疊很大,沒有明顯的Barcodinggap。

3.4 ITS2序列構建系統發育分析

3.4.1 ITS2堿基替換飽和性檢驗。系統發育樹的構建基于建樹序列是否達到飽和,針對已經達到飽和的序列不太適合建樹,因此對ITS2序列建樹之前進行堿基替換飽和性檢驗很有必要。ITS2序列序列飽和性檢驗值如表3所示,Iss.c(轉換值)遠遠大于Iss(替換值)且P值為0,說明ITS2堿基替換沒有達到飽和,適合遺傳發育樹的構建。

3.4.2 NJ法構建系統發育樹。為了增大樣本量,構建系統發育樹的序列除了課題組采集的10個樣品外,還從GeneBank下載了七葉鬼燈檠序列4個,西南鬼燈檠3個、羽葉鬼燈檠2個及1個梅花草屬梅花草基因作為外類群,GeneBank ID:MH045282.1、MH045359.1、MH045360.1、MH045366.1、MH045376.1、MH045377.1、MH045375.1、MH045341.1、MH045343.1、JF811095.1。采用NJ法對序列構建系統發育樹,判斷各樣品分支情況,結果見圖7,從基因庫下載的序列的9個序列及課題組代表性樣品序列均不能很好聚為一支,說明ITS2序列在巖陀種之間的鑒別并不理想,不適合作為巖陀種間的鑒別序列。

4 討論與小結

從核酸體外擴增的設想到聚合酶鏈式反應的發明,歷經10年之久,為分子生物學及其相關領域的研究提供了經典的實驗方法。PCR擴增反應是特異的、高效的,任何一種因素控制不當都會影響目標產物的擴增。針對不同的研究對象和儀器,均需要摸索其最佳反應條件,這是利用分子生物學鑒別物種和遺傳多樣性研究的基礎。影響PCR擴增反應的因素有很多。首先,引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。在引物的設計過程中應該注意到:①引物的長度不能過長,一般為20bp左右;②引物堿基中G+C含量以45%~55%[7]為宜,G+C含量太少擴增效果不佳,G+C含量過多易出現非特異條帶。堿基A、T、G、C最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶脫氧核苷酸的成串排列。其次,Taq DNA聚合酶的濃度,PCR擴增反應是DNA的體外擴增,選擇合適的酶量對擴增反應能否順利進行至關重要;再者,緩沖系統、dNTP的濃度、Mg2+的量的影響,選擇合適的濃度配比即是對Taq DNA聚合酶提供合適的反應環境,也是對擴增率的保障。最后,就是對模板濃度、溫度、循環周期的篩選。總之,在PCR特異性擴增反應中應該保證目標產物量的最大化。嚴格控制退火溫度,適當提高退火溫度可以減少不匹配的雜交,從而提高特異性;減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發及錯誤延伸;適當降低引物及酶的濃度可以減少非特異性擴增的發生;有效調整Mg2+濃度,降低Mg2+的濃度對Tap DNA聚合酶的活性有直接的影響;PCR擴增產物要盡快完成電泳檢測,延時電泳檢測會出現電泳條帶不規則或消失的現象。

針對ITS2序列對巖陀種間鑒別能力研究,本研究采用種內種間遺傳差異分析,Barcoding gap及系統發育3個方面的分析,均不能很好對巖陀3個種進行鑒別。筆者通過閱讀大量文獻得出,ITS2在種水平鑒別率達到97.2%[8],但作為巖陀種DNA條形碼鑒別不太適合。因此,課題組在今后巖陀種DNA條形碼鑒別研究中準備采用葉綠體基因psbA-trnH、matK、rbcL序列及多片段組合的方法對巖陀種(西南鬼燈檠、七葉鬼燈擎、羽葉鬼燈檠)的3個物種進行鑒別研究。另外,本研究中雖然未能利用ITS2序列對巖陀種進行區分鑒別,但實驗中建立的PCR擴增反應體系希望能為其它DNA條形碼鑒別研究中PC R擴增條件的探索提供借鑒和幫助。(收稿:2018-12-20)

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