嗜水氣單胞菌感染對黃鱔Moronecidin基因表達的影響

2019-07-08 03:30:59 江蘇農業科學2019年10期

張釗 涂嬌 張小雪

摘要:為研究嗜水氣單胞菌對黃鱔Moronecidin基因表達的影響,用不同濃度嗜水氣單胞菌菌液感染健康黃鱔,采用熒光定量PCR方法分別檢測染菌黃鱔脾臟、腎臟和肌肉中Moronecidin基因在感染后12、24、48 h的表達量。結果表明,Moronecidin基因在健康黃鱔的上述3種組織器官中都有表達;腹腔注射嗜水氣單胞菌后,該基因的表達量明顯升高。隨著感染時間的延長,3種組織器官中Moronecidin基因的表達量在處理1(菌液濃度為1億CFU/mL)均呈現逐漸升高的趨勢,處理2(菌液濃度為2億CFU/mL)脾臟中Moronecidin基因的表達量隨處理時間延長而逐漸升高,而腎臟和肌肉中的表達量則呈先升高后降低的趨勢;處理3(4億CFU/mL)Moronecidin基因的表達量在3種組織器官中均逐漸降低。

關鍵詞:黃鱔;嗜水氣單胞菌;Moronecidin基因

中圖分類號: S917? 文獻標志碼: A? 文章編號:1002-1302(2019)10-0188-05

魚類依賴非特異性免疫系統通過產生各種免疫細胞[1-2]、免疫因子[3-4]等非特異性的識別并作用于病原體,達到清除體內抗原、抵御水生環境中各種病原體入侵的目的。抗菌肽(AMPs)是非特異性免疫系統的重要組成成分,存在于植物、動物以及人類等幾乎所有的生命體中,具有抗菌譜廣、高效、熱穩定性強、不產生耐藥性等特點[5-6]。研究發現,抗菌肽除了具有直接抑制細菌、真菌、病毒和原蟲的抗菌活性外,還具有增強免疫細胞趨化性[7]、抑制炎癥[8-9]和激活免疫細胞[10]等生物學活性。

Moronecidin抗菌肽屬于Piscidin(毒魚豆素)家族,其家族成員包括dicentracin、epinecidin、myxindin以及胸腺素[11]等。2002年Lauth等從雜交條紋鱸魚(Hybrid striped)的鰓和皮膚中首次分離獲得Moronecidin抗菌肽,并驗證了它對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌活性[12];2008年Falco等的研究表明,在感染病原體后,虹鱒各組織器官中Moronecidin抗菌肽的表達量最高[13]。同時,在其他魚類體內也相繼發現了Moronecidin抗菌肽,包括大西洋鱈魚(Gadus morhua)[14]、真鯛(Chrysophrys major)[15]、歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)[16]、石斑魚(Epinephelus coioides)[17]等。到目前為止,Moronecidin抗菌肽僅被發現存在于魚類中。有關Moronecidin基因的研究發現,比目魚完整的Moronecidin基因cDNA序列包含1個信號肽和磷酸腺苷(AMP)12域[18],而條石鯛魚中Moronecidin基因的編碼區含有204bp,共67個氨基酸殘基,并預測其三級結構是一種兩親性螺旋結構[19]。前人關于Moronecidin基因的研究主要集中在海洋魚類,而有關該基因在淡水魚黃鱔體內表達的情況尚未見報道。

本研究以黃鱔Moronecidin基因為研究對象,通過熒光定量PCR技術檢測該基因在感染嗜水氣單胞菌后黃鱔脾臟等3種組織器官中的表達量變化,為進一步探討黃鱔免疫機制,實現新型藥物的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與菌株

試驗用60尾黃鱔[體質量為(104.5±13.1) g]采集于貴州省貴陽市花溪地區池塘和田間;試驗用嗜水氣單胞菌菌株(編號:ATCC7966)由貴州大學動物科學學院陳江鳳老師饋贈。

1.2 主要儀器設備和試劑

1.2.1 主要儀器設備 VD-650超凈工作臺、101-2型電熱鼓風干燥箱、80-1電動離心機、光學顯微鏡CH20BIMF200、血球計數板、FA1004電子天平、78-1磁力加熱攪拌器、HZQ-F160型恒溫搖床、高壓滅菌鍋、80-2112-21型紫外分光光度儀、PTC-1148 PCR擴增儀、DYY-6C型電泳儀、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計、C1000 Touch熒光定量PCR儀、Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統。

1.2.2 主要試劑與試劑盒 無水乙醇、三氯甲烷、瓊脂糖、Gold View染液[生工生物工程(上海)股份有限公司]、loading buffer[生工生物工程(上海)股份有限公司]、DM2000(鼎國生物公司)、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN)、TransStart Tip GreenqPCR SuperMix(TransGen Biotech)、Taq PCR Master Mix(TransGen Biotech)。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌液培養及配制 制備LB固體培養基,取儲存的菌株涂抹在培養基上,經復壯后轉移到液體培養基中,于28 ℃恒溫搖床培養24 h,取少量菌液離心提純,加入少量無菌生理鹽水稀釋后用平板活菌計數法測定菌液濃度。稀釋菌液濃度至 4億CFU/mL 備用。

1.3.2 試驗分組感染 清洗養殖所用水箱,以0.7%生理鹽水浸泡 1 d。將黃鱔隨機分成4組,每組15尾,放入水箱用無氯水暫養2 d。對照組每尾注射0.2 mL生理鹽水。其余3組為處理組,按照注射菌液的濃度分為處理1(每尾黃鱔注射02 mL濃度為1億CFU/mL的嗜水氣單胞菌菌液)、處理2(每尾黃鱔注射0.2 mL濃度為2億CFU/mL的嗜水氣單胞菌菌液)、處理3(每尾黃鱔分別注射0.2 mL濃度為 4億CFU/mL 的嗜水氣單胞菌菌液)。注射后用乙醇棉球對注射部位進行消毒,然后放入水箱中,并加蓋防逃。

1.3.3 組織取樣 分別在感染嗜水氣單胞菌12、24、48 h后進行取材,每個濃度組各時間點分別取5尾黃鱔,解剖并分別取腎臟、脾臟、肌肉等置于無酶冷凍管中,迅速放入液氮冷凍后轉入-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.4 引物的設計與合成 根據轉錄組測序獲得的抗菌肽Moronecidin基因序列,并參考GenBank中該基因序列,使用Primer Premier 5.0進行引物的設計,參照王霞等的研究結果[20],內參基因選擇黃鱔的β-actin基因。引物合成由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成,用去離子水溶解后于-20 ℃保存。引物序列信息如表1所示。

1.3.5 樣品總RNA的提取及檢測

1.3.5.1 總RNA的提取 使用天根生化科技(北京)有限公司生產的RNAsimple Total RNA Kit進行總RNA的提取。

1.3.5.2 總RNA的檢測 對RNA樣品進行超微量紫外分光光度和凝膠電泳雙重檢測。凝膠制備和電泳檢測:稱取瓊脂糖0.66 g,裝入錐形瓶中,加入70 mL TAE緩沖液,加熱煮沸后于室溫靜置冷卻至50 ℃左右,加入核酸染料5 μL,搖勻后迅速倒膠。將提取的總RNA樣品置于冰上解凍,取1 μL loading buffer(上樣緩沖液)與4 μL RNA樣品混合,點樣,電泳。

1.3.6 cDNA第一鏈的合成 選擇質量較高的RNA樣品進行cDNA第一鏈的合成,合成前將樣品RNA濃度調成一致,使用天根生化科技(北京)有限公司生產的試劑盒對提取的總RNA進行反轉錄,按說明書步驟在冰上進行操作(為減少試驗誤差,保證每個反應管準確加入反應液,進行反應前將各反應液按比例混合配成混合液,再分裝到各管),具體如下:

(1)將RNA樣品以及反轉錄試劑盒內所有試劑解凍后置于冰上,使用前用漩渦振蕩器混勻并簡短離心。

(2)去除基因組:配制混合液(2 μL 5×gDNA緩沖液,1 μL 總RNA,用RNase-Free ddH2O補足至10 μL),充分混勻并簡短離心,42 ℃條件下孵育3 min后置于冰上。

(3)配制混合液(2 μL 10×Fast RT Buffer,1 μL RT Enzyme Mix,2 μL FQ-RT Primer Mix,用RNase-Free ddH2O補足至10 μL),混勻,簡短離心。

(4)將反轉錄反應中的Mix,加到gDNA去除步驟的反應液中,充分混勻,簡短離心,42 ℃孵育15 min。

(5)95 ℃孵育3 min后置于冰上,所得cDNA用β-actin引物進行擴增以檢測質量,用于后續試驗或低溫保存。

1.3.7 PCR反應體系及程序

1.3.7.1 PCR反應體系 20 μL PCR反應體系如下:Taq PCR Master Mix 10 μL(1×),模板cDNA 1 μL (0.1~10 ng),Primer F(10 μmol/L) 1 μL(0.5 μmol/L),Primer R(10 μmol/L) 1 μL(0.5 μmol/L),RNase-Free ddH2O 7 μL。

1.3.7.2 Moronecidin PCR反應程序 反應程序如下:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,51 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,31個循環;72 ℃終延伸10 min。

1.3.8 瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因 稱取0.66 g瓊脂糖倒入錐形瓶中,加入60 mL 1×TAE緩沖液,加熱煮沸溶解后,放置于室溫下冷卻至50~60 ℃(不燙手),加入5 μL Gold View染液,用玻璃棒攪拌均勻,迅速倒入制膠板,插入梳子。冷卻凝固后取出梳子,加樣,放入電泳槽,100 V電泳20 min左右,凝膠成像。

1.3.9 Moronecidin基因相對表達量的測定 以反轉錄所得cDNA作為熒光定量PCR的模板,對Moronecidin基因的相對表達量進行測定,建立標準曲線。反應體系和反應條件如下:

(1)熒光定量PCR反應體系。20 μL熒光定量PCR反應體系如下:10 μL 2× TransStart Tip Green qPCR SuperMix,0.4 μL(0.2 μmol/L)Primer-F,0.4 μL(0.2 μmol/L) Primer-R,2 μL模板cDNA,7.2 μL RNase-Free ddH2O。

(2)熒光定量 PCR 反應條件(兩步法)。具體步驟如下:94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s,51 ℃ 30 s,39個循環,熒光信號采集;95 ℃ 1 min,51 ℃ 1 min,95 ℃ 5 s,得到溶解曲線。

1.4 數據統計與分析

本試驗所得實時熒光定量PCR原始數據使用2-ΔΔCT方法進行處理,分析Moronecidin基因在黃鱔腎臟等3種組織器官中的表達量。處理后的數據使用統計軟件SPSS 17.0進行單因素統計分析,所得數據均為平均值±標準差,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取結果

試驗共提取了108個總RNA樣品。紫外分光光度計檢測顯示,總RNA的濃度在130~800 ng/μL之間,且D260 nm/D280 nm值在1.8~2.0之間,證明總RNA濃度和純度較高。電泳檢測結果顯示,28S和18S條帶清晰,證明總RNA完整,可用于后續PCR試驗。

2.2 cDNA檢測及β-actin cDNA PCR擴增結果

取1 μL cDNA,超微量紫外分光光度計測定結果顯示,cDNA濃度均在1 000 ng/μL以上,且D260 nm/D280 nm值在 1.8~2.0之間,說明cDNA濃度較高且完整,可用于下一步熒光定量PCR試驗。由圖1可知,以反轉錄所得cDNA為模板,用β-actin引物進行擴增,并通過凝膠電泳成像進行檢測,得到的條帶分明,無雜帶,每組獲得的DNA片段均在 344 bp 左右,說明β-actin基因在黃鱔RNA樣品中的表達穩定,可作為內參基因使用。

2.3 cDNA的PCR擴增

分別在健康黃鱔3種組織器官樣品中挑選4個cDNA樣品作為模板,對Moronecidin目的基因進行擴增,用瓊脂糖凝膠電泳檢測并成像(圖2),所得條帶單一明亮,每組均擴增得到約291 bp的DNA片段,說明Moronecidin基因在健康黃鱔中有表達。

2.4 引物特異性檢測

通過qRT-PCR技術檢測分析感染嗜水氣單胞菌后黃鱔各時間點脾臟、腎臟、肌肉組織中Moronecidin基因的表達量,得到β-actin基因擴增曲線和溶解曲線(圖3)、Moronecidin基因擴增曲線和溶解曲線(圖4)。由圖3和圖4可以看出,2個基因擴增曲線均呈“S”形,且曲線平行性好,2個基因的溶解溫度分別為82.5 ℃和86.5 ℃,溶解曲線峰值單一,說明設計的熒光定量引物特異性較好,沒有引物二聚體和產生非特異性擴增。

2.5 Moronecidin基因表達量的變化

以β-actin為內參作對照,在不同處理濃度和處理時間下,對Moronecidin基因在黃鱔3種組織器官中的相對表達量進行檢測,檢測結果采用2-ΔΔCT法進行計算,結果以對照組 12 h 的表達量為對照,設置其數值為1。

2.5.1 脾臟Moronecidin基因的表達 由圖5可知,隨著試驗時間的推移,對照組脾臟Moronecidin基因的表達量有些許升高 但差異不明顯。處理1和處理2在感染嗜水氣單胞菌后,Moronecidin基因表達量均隨著處理時間的延長而增加,且增加顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01);處理2在感染24 h和48 h時Moronecidin基因表達量極顯著提高(P<0.01);而處理3則隨感染時間的延長,Moronecidin基因表達量與對照相比呈先升高后降低的變化趨勢,且隨著處理時間的延長,表達量下降十分明顯。與對照組相比,各處理組Moronecidin基因表達量整體呈上調趨勢,處理2在感染48 h時,基因表達量達到最高值。

2.5.2 腎臟Moronecidin基因的表達 由圖6可知,隨著試驗時間的延長,對照組腎臟Moronecidin基因相對表達量有些許變化,但差異不明顯。各處理組在感染初期,腎臟Moronecidin基因表達量均增加,隨著處理菌液濃度的升高,Moronecidin基因表達量在12 h內均增加;處理2在24 h達到最高值,而處理3在12 h與對照相比增加極顯著;處理2的相對表達量在12~48 h內呈先增加后降低的趨勢,處理3則持續降低。

2.5.3 肌肉Moronecidin基因的表達 由圖7可知,對照組肌肉中Moronecidin基因相對表達量變化不明顯。與對照組相比,在感染嗜水氣單胞菌后,黃鱔肌肉中Moronecidin基因表達量均升高;處理1該基因的表達量隨著處理時間的增加而增加,而處理2先增加后降低,在感染24 h時該基因的相對表達量達最高值,差異極顯著,但隨著處理時間的延長,該基因表達量又明顯下降;處理3在感染初期該基因的表達量最高,而后持續下降到對照組水平。

3 討論

3.1 Moronecidin基因在不同魚類器官中的表達量

研究表明,Moronecidin基因在多種健康魚類的各組織器官(如脾臟、腎臟、肝臟、肌肉、心臟、胃等)中均有表達,但表達量的差異并不顯著。用細菌或病毒誘導后,Moronecidin基因表達量顯著升高,且在不同器官中的表達量變化情況不同:條石鯛(Oplegnathus fasciatus)在感染真鯛虹彩病毒后,Moronecidin基因表達量顯著升高,且在脾臟中的表達量最高,在頭腎和鰓中次之[19];通過注射殺鮭氣單胞菌進行誘導,提高了大西洋鱈魚(Gadus morhua)脾臟、頭腎中Moronecidin基因表達量,且脾臟中24 h時的表達量變化最顯著[21]。與前人的研究結果類似,本試驗中Moronecidin基因在健康黃鱔的脾臟、腎臟和肌肉中均有表達,且該基因的表達量在感染嗜水氣單胞菌初期均明顯上調,隨注射菌液的濃度升高而發生顯著變化。在脾臟中該基因的表達量相比另外2種組織器官高,其次是腎臟,肌肉中的表達量相對較低。試驗結果表明,在魚類受到病菌感染時,Moronecidin基因在免疫系統中的表達量顯著增加,說明其編碼的抗菌肽參與了抵抗病菌的侵擾。但對于不同的魚和感染不同的菌時,其表達量升高的時間和升高的量卻有所不同。

3.2 Moronecidin基因的表達量與黃鱔臟器功能的相關性

在感染嗜水氣單胞菌48 h后,處理2和處理3的3種組織器官中Moronecidin基因表達量均有下降趨勢,推測原因可能是感染初期,黃鱔機體的免疫應答功能正常,Moronecidin基因表達量隨著感染時間和感染菌濃度的增加逐漸增加;但在感染后期,黃鱔身體的免疫功能不敵病菌的攻擊,黃鱔臟器免疫應答能力下降,導致黃鱔抗菌肽合成能力降低。這是影響Moronecidin基因后期表達量的可能原因之一。

3.3 嗜水氣單胞菌感染和取材時間的確定

研究表明,黃鱔在感染嗜水氣單胞菌12 h后就開始表現出出血病的癥狀[22],其臟器功能受到嚴重損傷,72 h后全部死亡[23]。本試驗根據前人的研究以及預試驗的情況,選擇在48 h內取材,以避開染菌黃鱔全部死亡而無材料可取的問題。

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