血紅鉚釘菇子實體化學成分GC-MS分析及石油醚萃取物抗腫瘤活性組分篩選

2019-07-08 03:30:59 江蘇農業科學2019年10期

都君 張紅 陳屏

摘要:為了分析血紅鉚釘菇子實體的化學成分并對其石油醚萃取物進行抗腫瘤活性篩選。試驗采用氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS),通過硅膠柱層析對石油醚萃取物進行組分分離,采用CCK-8法測定各組分對人肺癌細胞(NCI-H460)和人胃癌細胞(SGC-7901)的增殖抑制作用。結果表明,從血紅鉚釘菇子實體中共鑒定出60個化合物,占提取物總量的96.074%。主要以烷烴類、醛酮類、酯類、脂肪酸類為主,分別占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%。石油醚萃取物經硅膠柱層析分離共得8個組分(A、B、C、D、E、F、G、H),其中組分(A、B、C、H)對人肺癌細胞(NCI-H460)有增殖抑制作用,組分(A、B、C、F、H)對人胃癌細胞(SGC-7901)有增殖抑制作用,并均呈濃度依賴性。組分(A、B、C、H)對人肺癌細胞(NCI-H460)的IC50分別為790.46、842.05、876.12、1 479.55 μg/mL,組分(A、B、C、F、H)對人胃癌細胞(SGC-7901)的IC50分別為619.29、465.45、1 137.88、1 096.11、754.48 μg/mL。說明通過對血紅鉚釘菇子實體GC-MS分析及抗腫瘤活性篩選,石油醚萃取物組分(A、B、C、F、H)具有一定的抗腫瘤活性,可能含有抗腫瘤活性的單體化合物。

關鍵詞:血紅鉚釘菇;氣相色譜-質譜;細胞增殖;脂肪酸;硅膠柱色譜;癌細胞

中圖分類號: O657.63? 文獻標志碼: A? 文章編號:1002-1302(2019)10-0197-04

血紅鉚釘菇[Chroogomphus rutilus (Schaeff.) O. K. Mill.]屬擔子菌亞門牛肝菌目鉚釘菇科(Gomphidiaceae)鉚釘菇屬(Chroogomphus),分布于中國(吉林、黑龍江、遼寧、河北、山西、云南、四川、西藏、廣東、湖南等地區)、日本、歐洲及北美等地[1],主要生長于北溫帶[2]。其子實體呈鉚釘狀且菌肉為酒紅色,故名血紅鉚釘菇。在我國東北地區俗稱松樹傘、松蘑、紅蘑、松樹釘、肉蘑、雞血蘑[3],其營養價值極高,深受人們喜愛,是現今仍不能人工馴養的野生食用菌珍品[4]。此外,血紅鉚釘菇具有很好的藥理活性,具有神經元保護作用,抗氧化、抗病原菌作用,促生長等功效,還具有降血糖和抗癌等作用[5-6]。因此,血紅鉚釘菇具有很大的開發價值。本試驗通過氣相色譜-質譜技術對血紅鉚釘菇化學成分進行分析研究及抗腫瘤活性的篩選,為血紅鉚釘菇的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗于吉林農業大學教育部食藥用菌工程研究中心(2015年12月至2017年12月)進行。血紅鉚釘菇干品由吉林農業大學中藥材學院包海鷹教授鑒定。

氣相色譜-質譜聯用儀,旋轉蒸發儀RE-5210(上海亞榮生化儀器廠),循環水式多用真空泵S-B95A(湖南省鞏義市英峪儀器廠)、電子天平AL-104[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]、恒溫水浴鍋HH4(金壇市江南儀器廠)、CO2培養箱 BPN-80CH型(上海一恒科學儀器有限公司)、680型酶聯免疫酶標儀(美國Bio Rad公司)、離心機TD4ZWS(上海安亭科學儀器制造廠)、XD-101型倒置顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)。

細胞增殖和細胞毒性試劑盒CCK-8(廣州貝博生物科技有限公司)、0.25%胰蛋白酶(上海索萊寶生物科技有限公司)、乙醇和石油醚(分析級,北京化工廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 氣相色譜-質譜分析條件 (1)氣相色譜條件。色譜柱:DB-5型石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 nm);升溫程序:起始溫度8 ℃,升溫速率1 ℃/min,升溫至15 ℃,升溫速率至3 ℃/min,升溫達到250 ℃,升溫速率達到 10 ℃/min,待溫度升高到280 ℃時持續5 min;氮氣流速為1.0 mL/min;分流比為50 ∶ 1。(2)質譜條件。質量掃描范圍:質荷比20~880;電子轟擊離子源;電子能為70 eV;電壓為 0.75 kV;電子源溫度為2 ℃。

1.2.2 CCK-8法抗腫瘤活性組分篩選 (1)樣品制備 血紅鉚釘菇干品粉碎,95%乙醇按1 ∶ 4(體積分數)量回流提取2次,每次3 h,合并提取液,減壓濃縮得乙醇浸膏。乙醇浸膏揮干后加蒸餾水混懸,加入石油醚按1 ∶ 1(體積分數)量萃取,石油醚萃取物減壓濃縮得石油醚浸膏。將石油醚浸膏用丙酮溶解,與硅膠(100~200目)按1 ∶ 2伴樣,干法上硅膠柱(73 mm×305 mm),流動相為石油醚-乙酸乙酯[A(9 ∶ 1)、B(8 ∶ 2)、C(7 ∶ 3)],四氯甲烷-甲醇[D(10 ∶ 0)、E(9 ∶ 1)、F(8 ∶ 2)、G(7 ∶ 3)、H(0 ∶ 10)],合并相同比例組分,減壓濃縮,共得8個組分(A、B、C、D、E、F、G、H)。(2)抗腫瘤活性篩選 采用CCK-8法,以人肺癌細胞(NCI-H460)和人胃癌細胞(SGC-7901)為受試對象。取2種細胞的對數生長期細胞,用0.25%的胰蛋白酶消化,計數,分別配成細胞懸液接種于96孔培養板中,每孔加細胞懸液100 μL(細胞密度分別為 6.00×103、3.25×104個/mL),置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。24 h后試驗組分別加入配制好的8個組分(A、B、C、D、E、F、G、H)10 μL,濃度梯度分別為400.000 0、200.000 0、100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 μg/mL。每個梯度設6個重復。空白組為100 μL培養液,對照組為100 μL細胞。置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中繼續培養。24 h后,每孔加入10 μL CCK-8 試劑盒,培養3 h后,用海標儀在 450 nm 波長下測定D值。抑制率計算公式為抑制率=1-[(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)]×100%。

2 結果與分析

2.1 血紅鉚釘菇子實體GC-MS分析結果

對血紅鉚釘菇子實體進行GC-MS分析,其總離子流圖如圖1所示,通過NIST庫進行自動檢索與標準物質譜圖進行對比分析,并結合質譜裂解規律確定其化學成分。從血紅鉚釘菇子實體中分析出60個化合物(表1),且以烴類,醛酮類、酯類、脂肪酸類為主,分別占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%,占檢識出總量74.335%。血紅鉚釘菇子實體中以脂肪酸為主要成分,含量較多的是正戊酸(11.236%)、十六烷酸(4.020%)、十四烷酸(2.055%)、十五烷酸(1.388%)。

2.2 抗腫瘤活性組分篩選

2.2.1 血紅鉚釘菇石油醚萃取物各組分對人肺癌細胞(NCI-H460)增殖的抑制作用 由表2可知,血紅鉚釘菇石油醚萃取物8個組分中,組分A、B、C、H對人肺癌細胞 NCI-H460 的增殖具有明顯的抑制作用,在濃度 400 μg/mL 時抑制率最大,分別為38.99%、31.52%、29.72%、23.37%。且組分A、B、C、H的抑制率隨劑量的增加而提高,具有良好的劑量-效應關系。通過SPSS計算其IC50分別為790.46、84205、876.12、1 479.55 μg/mL。而組分D、E、F、G沒有明顯的增殖抑制作用。

2.2.2 血紅鉚釘菇石油醚萃取物各組分對人胃癌細胞(SGC-7901)增殖的抑制作用 由表3可知,血紅鉚釘菇石油醚萃取物8個組分中,組分A、B、H對人胃癌細胞SGC-7901的增殖具有明顯的抑制作用,在濃度為 400 μg/mL 時,抑制率最大,分別為43.27%、47.74%、41.22%。組份C、F也具有一定的增殖抑制作用,在濃度為400 μg/mL時,抑制率分別為29.19%、33.49%。且組份A、B、C、F、H的增殖抑制作用均隨劑量的增加而提高,具有良好的劑量-效應關系。通過SPSS計算其IC50分別為619.29、465.45、1 137.88、1 096.11、754.48 μg/mL,而組份D、E、G并沒有明顯的抑制作用。

3 討論

本試驗通過GC-MS分析了血紅鉚釘菇子實體中的揮發性成分,共鑒定出60個化合物,以烷烴類、醛酮類、酯類、脂肪酸類為主,分別占13.503%、17.317%、17.777%、25.738%,占檢識出總量74.335%。其主要成分為正十七烷(2.594%)、甲基庚烯酮(2.835%)、硬酯酸異丁酯(7.563%)、正戊酸(11.236%)、十六烷酸(2.844%)。有研究表明脂肪酸具有抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等作用[7]。血紅鉚釘菇具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、促生長、神經元保護等多種藥理活性,而這些生物活性與其具有豐富的脂肪酸類化合物可能有著一定的聯系[8-12]。

采用硅膠柱層析對血紅鉚釘菇石油醚提取物進行分離,得到8個組分。通過CCK-8法測定各組分對人肺癌細胞(NCI-H460)和人胃癌細胞(SGC-7901)的增殖抑制作用,其中組分A(石油醚 ∶ 乙酸乙酯=9 ∶ 1)、B(石油醚 ∶ 乙酸乙酯=8 ∶ 2)、C(石油醚 ∶ 乙酸乙酯=7 ∶ 3) 、H(四氯甲烷 ∶ 甲醇=0 ∶ 1)對2種腫瘤細胞均具有比較明顯的增殖抑制作用,組分F(四氯甲烷 ∶ 甲醇=8 ∶ 2)對人胃癌細胞(SGC-7901)具有一定的增殖抑制作用,而對人肺癌細胞(NCI-H460)無明顯效果。組分D(四氯甲烷 ∶ 甲醇=1 ∶ 0)、E(四氯甲烷 ∶ 甲醇=9 ∶ 1)、G(四氯甲烷 ∶ 甲醇=7 ∶ 3)對2種細胞均無明顯抑制效果。可以說明組分A、B、C、F、H為抗腫瘤活性組分,可能含有抗腫瘤活性的單體化合物,有待進一步開發研究。

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